01 История исследований и разработок и проблемы
1.1 Предыстория разработки препарата МК-0616
Энлицитида деканоат (также известный как MK-0616) — первый полностью разработанный de novo пероральный ингибитор макроциклического пептида PCSK9, предназначенный для снижения уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C) и лечения атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний.
Как показано на рисунке выше, помимо МК-0616, классическими примерами в этой области также являются антибиотик ванкомицин (2), химиотерапевтический агент паклитаксел (3) и противораковый препарат эрибулин (4). Сложная структура соединений 2 и 3 означает, что их фактический синтез по-прежнему основан на полусинтетических методах, основанных на натуральных продуктах; напротив, команда Эйсай достигла полного синтеза соединения 4 за более чем 60 этапов, что стало важной вехой в синтезе поликетидных соединений.
Что касается МК-0616, то его химическая структура весьма уникальна: это первая молекула, полностью созданная с нуля (а не полученная из природных источников); более того, поскольку он является пероральным ингибитором PCSK9 для ежедневного применения, предназначенным для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, а не для онкологических или противоинфекционных применений, его глобальный спрос будет намного превышать спрос на традиционные инновационные лекарства, что потребует производства в масштабах от сотен килограммов до нескольких тонн.
1.2 Синтетические задачи и стратегии
Молекулярная сложность МК-0616 предъявляет строгие требования к разработке процесса.
Структурные характеристики: Хотя МК-0616 происходит от макроциклического пептида, идентифицированного с помощью технологии отображения мРНК, он содержит 6 неканонических аминокислот (всего 8 аминокислотных единиц), 37-членный макроцикл, боковую цепь аммониевой соли (10) и непептидный фрагмент (13), что делает традиционные методы твердофазного синтеза пептидов совершенно неэффективными, как показано ниже.
Основные проблемы, которые необходимо решить
1、Стабильность полярных интермедиатов (особенно для фрагментов солей аммония, где противоион необходимо контролировать на протяжении всего процесса)；
2、Селективность замыкания большого кольца (требуется оптимизация последовательности сборки среди 10 блоков)；
3、Проблемы масштабирования (избегайте хроматографической очистки; обеспечьте производительность в масштабе от миллиграмма до килограмма)；
Поэтому, Ключевое решение, предложенное исследователями, заключается в следующем：
1、разделяй и властвуй：Отдайте приоритет построению «северного фрагмента» (17-членного кольца, состоящего из неканонических аминокислот в положениях 5, 6 и 7) и упростите стратегию макроциклического расщепления с помощью ретросинтетического анализа (например, путем выбора амидной связи между положениями 5 и 8).
2、Введение в терминальную боковую цепь：Фрагмент полярной соли аммония (10) следует оставить для заключительного этапа установки, чтобы избежать проблем, связанных с промежуточной очисткой.
3、Гибкое применение кислоты–реакции нейтрализации оснований (RCM)：В положениях 7 образуется цепь, связанная н-гексаном.–13; эта реакция демонстрирует превосходную ортогональность и может проводиться в несколько стадий.
Благодаря этой серии стратегий исследователи в конечном итоге создали масштабируемый синтетический путь, открывающий путь для клинической оценки.02
02 Синтетическая стратегия и оптимизация
Посредством аналитических исследований исследователи выполнили многоэтапную оптимизацию нескольких поколений ключевого макроциклического фрагмента (северного фрагмента) и оптимизировали сборку южного фрагмента с конечным продуктом.
2.1 Многопоколенная оптимизация Северного сегмента:
Первое поколение– 37 итераций
Синтез неканонических аминокислот (например, 3-гидроксипролина) малоэффективен, так как основан на неэффективных реакциях циклизации.—например, конденсация Дикмана—а также киральное разрешение; кроме того, этот процесс требует нескольких раундов манипуляций с защитной группой и нескольких хроматографических очисток, как показано на рисунке ниже.
Все эти факторы ограничивают масштабный синтез целевых фрагментов.
Синхронная система второго поколения
Прорыв был достигнут благодаря биокатализу: введение восстановления кетонов (KRED) позволило высокоэффективно и стереоселективно восстанавливатьβ-гидроксиэфиры; кроме того, для синтеза фторированного триптофана использовался сконструированный фермент TrpB, тем самым устраняя необходимость в хиральном разрешении. В результате количество этапов синтеза было сокращено, а использование защитных групп сведено к минимуму, как показано на рисунке ниже.
Этот синтетический путь оптимизации северного фрагмента также применялся в клинических разработках; однако возможности, возникающие благодаря структурной стратегии, создали необходимость в дальнейшей оптимизации пути синтеза фрагментов.
Во-первых, ключевые результаты, касающиеся трех промежуточных продуктов поздней стадии кристаллизации, обеспечивают критическую точку для контроля чистоты; поэтому важно изменить путь синтеза, чтобы перехватить эти три промежуточных продукта.
Во-вторых, реакцию циклотримеризации олефинов рекомендуется проводить как можно позже в процессе синтеза. Этот подход основан на соображении, что рутениевые катализаторы могут увеличить общую стоимость производства бензотиурамина; Таким образом, выполнение этой реакции на заключительном этапе пути синтеза может значительно снизить затраты.
Таким образом, это облегчило оптимизацию подхода третьего поколения.
Система общего шага третьего поколения
Посредством ферментативного гидроксилирования L-пролин напрямую окисляется до 3-гидроксипролина со стереоселективностью, превышающей 99:1; были идентифицированы ключевые промежуточные соединения, такие как кристалличность бензолсульфонатной соли, что позволило избежать хроматографической очистки; использовалась модульная сборка, а также корректировка последовательности связывания аминокислот и упрощение стратегии защитной группы, как показано на рисунке ниже.
Синтетический северный фрагмент МК-0616 третьего поколения отличается от фрагментов, синтезированных в двух предыдущих поколениях. Этот выбор был обусловлен идентификацией кристаллического пентаноата 91, в котором отсутствует аминокислотный остаток треонина (который будет включен позже во время синтеза). Эту соль можно выделить с высоким выходом и чистотой, и она обеспечивает высокостабильное промежуточное соединение, которое можно хранить в качестве ключевого промежуточного продукта на протяжении всего процесса синтеза.
Благодаря оптимизации третьего поколения разделение недавно разработанного северного фрагмента (91) теперь требует всего 14 шагов.—всего лишь одна треть от количества шагов, необходимых для синтеза первого поколения. Кроме того, важно отметить, что в протоколе третьего поколения самая длинная линейная последовательность сокращена более чем вдвое, уменьшившись с 20 шагов до 9 шагов.
2.2 Оптимизация южного фрагмента
Первое поколение, состоящее из 15 ступеней
Начиная с сырья, закупаемого в больших количествах у коммерческих поставщиков, девятиэтапный процесс представляет собой самую длинную линейную последовательность, как показано на рисунке ниже.
Синхронная система второго поколения
В синтезе второго поколения было улучшено не количество стадий, а скорее общая эффективность и контроль чистоты, как показано на схеме ниже. После тысяч испытаний был идентифицирован фрагмент Саузерн-блоттинга, названный солью лиламина (99).
Ранее было показано, что использование этих двух соединений служит нехиральными растворителями карбоновых кислот; следовательно, кристаллическая соль (99) неожиданно может быть получена в виде вещества высокой чистоты, что позволяет избежать обширной работы по препаративной ВЭЖХ, необходимой в предыдущем этапе синтеза.
2.3 Окончательная сборка изделия
И северный фрагмент первого поколения, и второй промежуточный продукт южного фрагмента можно легко защитить с получением линейного предшественника 61, как показано на рисунке ниже; однако выход продукта метатезиса циклоолефина очень низок.
Тем не менее, исследователи успешно применили другую последовательность, позволившую осуществить первый масштабируемый синтез МК-0616, как показано на схеме ниже.
Соли энальдегида первого поколения были синтезированы с помощью 63-этапного процесса, который начинается с установки боковых цепей на молекулярное ядро посредством высокопроизводительного амидирования с последующей очисткой SFC; среди этих шагов шаг 28 представляет собой самую длинную линейную последовательность.
Комбинация конечного продукта второго поколения показана на рисунке ниже.
Оптимизируя пути как для северного, так и для южного фрагментов, нацеленных на целевой продукт, оба подхода могут использовать кристаллические промежуточные продукты с плоскими фрагментами для перехода к финальной стадии синтеза.
Эта реакция сочетания является достаточно чистой, чтобы можно было сразу перейти к следующему этапу с использованием сырой реакции.
В целом синтетический маршрут второго поколения для MK-0616 требует 43 шагов, из которых 21 шаг представляет собой самую длинную линейную последовательность. Эта последовательность уменьшает как общее количество шагов, так и длину самой длинной линейной последовательности по сравнению с процессом первого поколения на одну треть.
03 Ключевые технологические инновации
Анализ всего процесса оптимизации выявил несколько инноваций в ключевых технологиях, таких как:
1、Технология биокатализа:динамическое кинетическое разрешение KRED; TrpB-опосредованный ферментом синтез аналогов триптофана; прямое введение гидроксильных групп через пролингидроксилазу; и т. д.
2. Кристаллизационная очистка: Несколько промежуточных шагов—такие как метилсульфонат фрагментов нозерн-блоттинга или соль лиламина фрагментов нозерн-блоттинга—используются для достижения кристаллизационной очистки, тем самым устраняя необходимость в хроматографических колонках.
3. Стратегия ортогональной защитной группы: гибкое переключение между защитными группами, такими как Boc и Nosyl, для обеспечения селективности многоступенчатых реакций.
4. Соображения по зеленой химии: сокращение использования катализаторов на основе тяжелых металлов (например, рутениевых катализаторов) и перенос реакции РКМ на более позднюю стадию для снижения производственных затрат.
04 Резюме и перспективы
Эта статья демонстрирует гибкую интеграцию биокатализа и химического синтеза, подчеркивая при этом ключевую роль процессов кристаллизации и применяя модульный подход к проектированию, тем самым демонстрируя систематическую методологию, охватывающую от лабораторных исследований до промышленного производства. Эта работа представляет собой образцовый случай в области сложного молекулярного синтеза: общее количество шагов было сокращено с 63 в протоколе первого поколения до 43 в протоколе второго поколения, при этом выходы увеличились почти в 1000 раз и сделали возможным производство в тоннах. На протяжении всего процесса стратегический акцент делается на этапе кристаллизации, что позволяет избежать хроматографической очистки — особенность, которая делает его очень подходящим для крупнотоннажного производства. Кроме того, это исследование предоставляет техническую основу для синтетических подходов к другим сложным макроциклическим пептидам.
