Природные пептиды являются отличными «молекулярными ключами» — они обладают высоким сродством, хорошей селективностью и низкой токсичностью. Однако у них по своей сути есть три основных недостатка: они легко измельчаются протеазами, с трудом проникают через клеточные мембраны и остаются в организме слишком короткое время. За последние три десятилетия фармацевтические специалисты систематически устраняли эти недостатки с помощью «набора специальных аминокислот». В этой статье используется простой язык и большое количество диаграмм, которые помогут коллегам по исследованиям и разработкам CMC разобрать и понять этот набор инструментов от принципа до реализации.
I. Почему натуральных пептидов «недостаточно»
II. Обзор пяти основных стратегий модификации
III. N-метилирование
IV. α-Метилирование и Aib
V. Аминокислоты D-конфигурации
VI. Ненатуральные аминокислоты
VII. Комплексный пример: как производятся пероральные пептиды
VIII. Краткая справочная страница для коллег CMC
IX. Будущие тенденции дизайна: искусственный интеллект и технологии отображения
Использование природного полипептида (полностью состоящего из 20 аминокислот L-типа) непосредственно в качестве лекарства часто не длится более нескольких минут. Причину можно выразить одним предложением: метаболическая система человека по своей природе устроена так, чтобы распознавать и разрушать эту структуру. Конкретно оно проявляется в виде четырех взаимосвязанных вопросов.
① Деградация протеаз. Наиболее смертоносная плазма, печень, почки и желудочно-кишечный тракт заполнены пептидазами/протеазами (такими как ДПП-4, аминопептидаза, карбоксипептидаза, трипсин и т. д.), которые специфически распознают амидные связи L-типа и гидролизуют их. Период полувыведения природного GLP-1 в организме составляет всего около 1,5–2 минут.
②Плохая проницаемость мембран и затрудненное пероральное введение: большое количество амида NH на полипептидном скелете является сильным донором водородных связей и плотно обернуто молекулами воды, что затрудняет прохождение через гидрофобное ядро клеточной мембраны. Это основная причина, по которой подавляющее большинство пептидов можно вводить только путем инъекции.
③Полипептиды с низкой молекулярной массой (<5 кДа) благодаря короткому периоду полувыведения и быстрому почечному клиренсу быстро фильтруются и выводятся клубочками. В сочетании с ферментативным гидролизом уровень воздействия в организме трудно поддерживать, и требуется частое введение.
④Линейные полипептиды с конформационной гибкостью и плохой селективностью подобны «мягкой лапше» в растворе, с бесчисленными конформациями, быстро меняющимися. При связывании с мишенью потеря энтропии велика, аффинность не учитывается, и он также может ошибочно связываться с несколькими связанными рецепторами, что приводит к отклонению от цели.
Стратегия «специальных аминокислот», по сути, представляет собой точное восстановление этих четырех слабых мест: не нарушая фармакодинамическую конформацию, она модифицирует скелет и боковые цепи, позволяя молекуле «ускользать» от распознавания фермента, «удалять» лишние водородные связи и «запирать» активную конформацию, сохраняя при этом максимально возможное соответствие мишени.
Во-первых, используйте таблицу, чтобы получить общее представление. Следующие пять типов модификаций являются наиболее часто используемыми методами «специальных аминокислот» при разработке современных пептидных лекарств, и они будут подробно рассмотрены один за другим в последующих главах.
N-метилирование – это процесс замены водорода (n-H) на атоме азота амидной связи скелета на метильную группу (n-CH₃). Казалось бы, незначительное изменение может одновременно повлиять на четыре ключевых параметра фармакокинетики. Механизм его действия можно разделить на три уровня.
Каждый NH является сильным донором водородной связи, «закрепляющим» молекулу в водной фазе. N-метилирование, стирающее этот донор, уменьшает площадь полярной поверхности (ПСА) молекулы, позволяя молекуле «обезвоживаться» и проникать в гидрофобное ядро мембраны. Эффекты N-метилирования в нескольких сайтах могут накладываться друг на друга: классический аналог соматостатина Вебера-Хиршмана после N-метилирования в трех сайтах имеет пероральную биодоступность примерно 10%.
Метильная группа занимает пространство вблизи амидной связи. Активный карман протеазы не может правильно «перекусить» расщепляемую связь, тем самым значительно повышая метаболическую стабильность. Это физическая основа, согласно которой N-метилирование напрямую связано с устойчивостью к ферментативному гидролизу.
Обычные амидные связи почти все транс (транс), тогда как N-метилирование сближает разницу в энергии между цис (цис), облегчая переключение между цис-транс-конформациями. Таким образом, дизайнеры могут «побудить» молекулы сворачиваться в определенные активные конформации или образовывать внутримолекулярные водородные связи, чтобы скрыть полярные группы (что еще больше облегчает проникновение).
Этот иммунодепрессант представляет собой учебник по «синергетическому действию особых аминокислот». Это циклический пептид из 11 остатков, содержащий 7 скелетных N-метилирований и один D-аланин. Именно это плотное N-метилирование и циклизация позволяют ему сохранять оральную активность, обладая при этом чрезвычайно высокой метаболической стабильностью - он может «переодеваться» между водным раствором и мембранной средой, образуя внутримолекулярные водородные связи, чтобы скрыть полярность и пройти через мембрану, а затем открыться для связывания с мишенью в водной фазе. Таким образом, циклоспорин стал одним из немногих природных источников макроциклических пептидов, выходящих за рамки правила пяти, которые можно абсорбировать перорально.
N-метилированные аминокислоты представляют собой стерические затрудненные вторичные амины с низкой эффективностью связывания, медленной реакцией и высокой склонностью к рацемизации и укорочению дикетопиперазина (ДКП). Требуются более сильные связывающие реагенты (такие как HATU/COMU + добавки), увеличенное время связывания или двойное связывание, строгий контроль температуры и онлайн-мониторинг каждого этапа. Выбор местоположения очень чувствителен: N-метилирование в разных сайтах одной и той же последовательности может иметь совершенно разные эффекты на активность и проникновение, поэтому требуется скрининг каждого сайта.
N-метилирование включает водород на атоме азота. α-метилирование включает водород на α-углероде. Когда исходный водород на α-углероде заменяется метильной группой, α-углерод меняется с «трехзамещенного» на «тетразамещенный четвертичный углерод» (наиболее типичным примером является Aib, 2-аминоизомасляная кислота, которая эквивалентна добавлению еще одной метильной группы к α-углероду аланина и симметрична с обеих сторон). Это дает тройной эффект.
Конформационная блокировка (большая часть ядра)
Антипротеаза
Устранить хиральные недостатки
Природный GLP-1 точно вырезается из 8-й позиции N-конца с помощью DPP-4, период полураспада которого составляет всего от 1,5 до 2 минут. Ключевым действием семаглутида является замена аланина (Ala8) в 8-м положении на Aib (α,α-дизамещенный) – стерические препятствия четвертичного углерода делают DPP-4 «неспособным перекусить» этот участок, тем самым блокируя основной путь деградации от источника.
Три последовательные модификации увеличили период полураспада с минут до одной недели:
① Aib8 остается при резке DPP-4;
② Замена Arg34 позволяет избежать деградации в другом сайте и способствует липидоспецифическому сайту.
③ Двухцепочечная жирная кислота Lys26 (дикислота C18 + линкер) обратимо связывается с сывороточным альбумином и уклоняется от почечного клиренса.
Комплексные результаты: период полувыведения составляет примерно 165 часов (около 1 недели), препарат можно принимать один раз в неделю.
Aib также является аминокислотой со стерическими помехами с медленным связыванием. Аминокислоты, следующие за Aib-aib или AIB, часто требуют двойного связывания или сильной активации. Стоит отметить, что «неестественный» статус АИБ создает препятствия на пути рекомбинантной ферментации (рибосомы его не распознают). Следовательно, пептиды, содержащие Aib, такие как симаглутид, обычно основаны на твердофазном синтезе (SPPS) или гибридных стратегиях твердофазная + ферментация и комбинируются с сайт-специфической модификацией боковых цепей жирных кислот. Сложность процесса и контроль качества значительно выше, чем у обычных рекомбинантных пептидов.
Активный карман протеазы представляет собой «перчатку», созданную специально для L-субстрата. Когда D-аминокислоты заменяются вблизи связи расщепления, геометрическое соотношение между карбонильной группой субстрата и катализируемой ферментом триадой нарушается. Связь расщепления не может быть помещена в правильное реакционное положение, аффинность связывания резко падает, и гидролиз, таким образом, прекращается.
Переворачивает всю последовательность, заменяя каждый остаток на D-образный. Волшебство заключается в том, что относительное расположение боковых цепей в пространстве в значительной степени сохраняется, тем самым сохраняя первоначальную активность. Однако скелет полностью D, полностью невосприимчив к протеазам, и иммуногенность значительно снижена. Это мощный инструмент для разработки пептидов-челноков гематоэнцефалического барьера и пептидов длительного действия.
Цена на сырье D-аминокислот обычно выше, чем у L-типа, а поставщиков меньше. Следует уделять внимание контролю хиральной чистоты (эээ-значения) и энантиомерных примесей.
В дополнение к вышеупомянутым модификациям на уровне скелета, фармацевты также имеют на выбор сотни коммерческих «хорошо защищенных и хорошо активированных» строительных блоков из неприродных аминокислот. Они подобны конструкторам LEGO, собранным в последовательности по функциям.
«Специальные аминокислоты» касаются молекулярной стабильности и конформации. Чтобы превратить полипептиды в лекарства для перорального применения, на самом деле существует два независимых, но наложенных друг на друга пути «вхождения».
Первый этап: Выжить. Специальные аминокислоты (Aib, N-метилированные, D-типа) устойчивы к деградации желудочно-кишечными протеазами.
① Внутреннее молекулярное проникновение: N-метилирование уменьшает водородные связи / ПСА, циклизация + гидрофобные боковые цепи способствуют образованию внутримолекулярных водородных связей и сворачиванию «хамелеона».
② Способствование проникновению препарата: SNAC, деканоат натрия и TPE временно открывают/пересекают эпителиальный барьер кишечника.
Третий этап: Сохранение альбумина/конформации связывания боковой цепи жирной кислоты/конформации длительного действия для поддержания воздействия препарата в крови.
Молекулы будущего будут содержать все больше и больше «хитрых» неприродных аминокислот и макроциклических структур.
Дисплей мРНК (например, система RaPID) может проверять библиотеки пептидов в масштабе 10¹² - 10¹³ за один раз.
RFdiffusion, модифицированный AlphaFold (например, кодирование положения циклического пептида AfCycDesign) и генераторы обучения с подкреплением позволили с нуля создавать большие циклические/связывающие пептиды.
Блокировка связывания боковой цепи олефина α-спирали, замена водородной связи, фолдамер β/γ-аминокислот и инженерия скелета на атомном уровне постепенно решают традиционную проблему нацеливания на внутриклеточные белок-белковые взаимодействия (PPI).
Использование сайт-специфических сайтов конъюгации, обеспечиваемых неприродными аминокислотами, для прикрепления токсинов, нуклидов или флуоресценции с созданием «пептидной версии ADC». В то же время технология продвижения орального проникновения становится все более зрелой. «Специальные аминокислоты + препараты» позволят принимать перорально больше полипептидов, которые изначально предназначались только для инъекций.
