Биокаталитические каскады позволяют производить макроциклический пептид Энлицитид.

Исследуемый пероральный ингибитор PCSK9 компании MSD, энлицитид деканоат (МК-0616), является первым пероральным макроциклическим пептидным ингибитором PCSK9, продемонстрировавшим существенное снижение уровня холестерина ЛПНП у людей. Энлицитид был разработан на основе скрининга мРНК моноциклических пептидов и впоследствии стабилизирован посредством непептидных поперечных связей для создания структуры, состоящей из трех слитых макроциклов. Этот сложный октапептид содержит шесть неприродных и две протеиногенные аминокислоты, соединенные 12 амидными связями и центральным линкером из шести углеродных цепей. Традиционный химический синтез требует 43 стадий, манипуляций с защитными группами (почти половина стадий синтеза), хроматографической очистки и сильно разбавленной стадии метатезиса замыкания кольца, катализируемого рутением, что ограничивает масштабируемость и устойчивость.

Развитие химиоферментного производства

Ученые MSD разработали краткий и конвергентный химиоферментативный процесс производства энлицитида деканоата (1), который возможен за счет прямого связывания мономеров аминокислотными лигазами в сочетании с биокаталитическим лигированием пептидных фрагментов и макроциклизацией с использованием эстераз и иминредуктаз.

Ключевые достижения

Трехферментная каскадная сборка с использованием АТФ-лигазы

- Трехферментный каскад (две сконструированные АТФ-лигазы + рецикл АТФ) собирает тетрапептид из незащищенных аминокислот. АТФ-захватывающие лигазы (в частности, АТФ-зависимые аминокислотные лигазы, AAL) представляют собой ферменты, которые катализируют образование амидных связей между незащищенными аминокислотами или пептидами, используя АТФ в качестве источника энергии. Их механизм протекает через смешанный ангидридный промежуточный продукт, который позволяет осуществлять прямое соединение без необходимости использования защитных групп на нуклеофильном амине или активированных ацильных донорах. В этом исследовании исследователи использовали АТФ-лигазу из Bifidobacterium Teenis (BaAAL) и сконструированные варианты (Trp-BaAALEng и Phe-BaAALEng) для избирательного удлинения дипептида двумя неприродными аминокислотами (аналогами триптофана и фенилаланина) в каскаде из одного горшка. Эти лигазы имеют узкий, скрытый электрофильный карман, который принимает отдельные аминокислоты в качестве электрофилов (С-концевые субстраты), но может вмещать более длинные пептиды в качестве N-нуклеофилов. Эта селективность делает их идеальными для последовательной сборки пептидов без защитных групп от С-конца до N-конца. Израсходованный АТФ перерабатывается с использованием полифосфаткиназы (FbPPKWT) с недорогим гексаметафосфатом в качестве донора фосфата.

Региоселективная макролактамизация инженерной эстеразы (RsEstEng)

- Инженерная эстераза (RsEstEng) катализирует региоселективную макролактамизацию с образованием нозерн-фрагмента (выход 73%, вес 52 кг). RsEstEng получен из карбоксилэстеразы дикого типа (RsEst), идентифицированной из Roseibacillus sp. Его основная функция — гидролиз сложноэфирных связей. Путем направленной эволюции исследователи превратили его в катализатор региоселективной макролактамизации – образования макроциклической амидной связи – при синтезе нозерн-фрагмента (4) энлицитида. Он принимает стабильный объемистый трет-бутиловый эфир линейного тетрапептида (9) в качестве донора ацила для образования макроциклического пептида (4) с образованием внутримолекулярной амидной связи. Он достиг селективной циклизации без обнаруживаемых олигомеров и только с 0,8% побочных продуктов гидролиза сложного эфира, даже в условиях высокой ионной силы предыдущего ферментативного каскада.

Межмолекулярное лигирование инженерной тиоэстеразы (BlTEEng)

- Инженерная тиоэстераза (BlTEEng) осуществляет межмолекулярное лигирование северного (4) и восточного фрагментов (3) без эпимеризации. BlTEEng представляет собой модифицированную версию тиоэстеразного (TE) домена, первоначально вырезанного из нерибосомальной пептидсинтетазы (NRPS) Brevibacillus Laterosporus (BlTE). Тиоэстеразы дикого типа в системах NRPS обычно катализируют макроциклизацию или высвобождение линейных пептидов из белка-носителя через тиоэфирную связь. Сконструированные варианты BlTE показали некоторую активность, но отдавали предпочтение димерным побочным продуктам. Ферментативная инженерия переместила фермент на катализацию межмолекулярного лигирования с использованием более стабильных изопропилоксоэфиров вместо природных гидролитически лабильных тиоэфиров.

Четырехферментная каскадная макроциклизация восстановительного аминирования

- Четырехферментный каскад (PsIREDEng, KsKREDEng и ферменты рециркуляции кофакторов StLDHWT, TvADHWT) обеспечивает восстановительное аминирование макроциклизации с образованием бициклического диамина (выход 69%, вес 46 кг). KsKREDEng представляет собой сконструированную кеторедуктазу от Kyrpidia sp. Он катализирует окисление соединения бензилового спирта (10) до переходного альдегида (11), зависящего от НАД+. PsIRED представляет собой иминредуктазу Pseudogymnoascus sp. Это НАДФН-зависимый. PsIREDENg катализирует восстановительное аминирование альдегида (11) и существующего амина с образованием циклического имина (12) с последующим восстановлением до макроцикла вторичного амина (13). StLDHWT регенерирует НАД+ на окислительной стадии путем восстановления пирувата до лактата, тогда как TvADHWT регенерирует НАДФН на восстановительной стадии путем окисления изопропанола до ацетона.

Окончательная макроциклизация с помощью сконструированной тиоэстеразы PBP.

- Химическое соединение с западным фрагментом (2), за которым следует сконструированная пенициллинсвязывающая протеинтиоэстераза (SsPBP-TEEng), замыкает конечный макроцикл при высокой концентрации (70 г/л), преодолевая типичное ограничение разбавления (5 г/л в традиционном синтезе). Общий процесс включает три каскадных этапа, 7 инженерных + 3 вспомогательных фермента, общий выход 39 %, демонстрацию в многокилограммовом масштабе, чистоту >99 %, отсутствие хроматографии и отсутствие защитных групп. Эта работа обеспечивает устойчивый, масштабируемый план производства сложных макроциклических пептидов, значительно сокращающий количество шагов и отходов, одновременно повышая эффективность и доступность пациентов.